Исследование биоценоза влагалища у женщин репродуктивного возраста методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени

По данным многочисленных исследований как отечественных, так и зарубежных авторов, вагинальная флора представлена в основном бактериальными микроорганизмами (грамположительные, грамотрицательные аэробные, факультативно-анаэробные и облигатно-анаэробные микроорганизмы), различными представителями грибов, а также вирусами и простейшими, совокупность которых обеспечивает колонизационную резистентность. Дисбаланс вагинальной микрофлоры женщин представляет нарушение количественно-качественных взаимоотношений резидентных микроорганизмов - сапрофитных и условно-патогенных, населяющих мочеполовую систему в норме. Развитие нарушения вагинального микробиоценоза может сопровождаться метаболическими, иммунными нарушениями и в ряде случаев клиническими проявлениями, степень выраженности которых может варьировать от бессимптомного носительства до выраженной клинической манифестации. В свете подобного рассмотрения понятий нормофлоры и дисбаланса урогенитального тракта такие нозологии как бактериальный вагиноз, урогенитальный кандидоз, заболевания, ассоциированные с микоплазмой, могут являться частными проявлениями дисбаланса биоценоза в целом.

Многочисленные исследования доказали, что этиологическая структура урогенитальных инфекций, обусловленных условно-патогенной микрофлорой, как правило, представлена ассоциацией нескольких микроорганизмов. Клиническая картина, в свою очередь, характеризуется стертым, малосимптомным течением, отсутствием специфических клинических симптомов, склонностью к хронизации и многоочаговости инфицирования, что неизбежно приводит к поздней обращаемости, нередко уже на стадии развития осложнений со стороны репродуктивной системы. Все вышесказанное позволяет рассматривать проблему урогенитальных инфекций, ассоциированных с условно-патогенной микрофлорой, как актуальную, имеющую важное медикосоциальное значение.

В настоящее время для установления диагноза используют традиционные методы клинической и лабораторной диагностики. Клиническое обследование направлено на выявление жалоб, объективных клинических симптомов воспаления, получение результатов бимануального исследования. Другими словами клинический диагноз подразумевает установление формы течения заболевания, топики процесса, наличия или отсутствия осложнений.

Этиологически значимые инфекционные агенты выявляются с помощью методов лабораторного исследования. Традиционно лабораторное исследование включает микроскопию окрашенных препаратов, культуральное исследование.

С целью повышения эффективности диагностики урогенитальных инфекций, в том числе обусловленных условно-патогенными микроорганизмами, наряду со стандартными методологиями клинико-лабораторного обследования, включая ПЦР, предлагается новый способ диагностики, основанный на методе ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с использованием тест-системы "Фемофлор" (ООО "НПО ДНК-Технология"). В основу способа положена комплексная количественная оценка биоты с проведением сравнительного анализа конкретных представителей нормо- и условно-патогенной флоры с общим количеством микроорганизмов с целью выявления дисбаланса биоценоза, степени его выраженности и определения этиологической роли конкретных условно-патогенных микроорганизмов в его развитии при условии контроля качества получения клинического образца для исследования.

Материалом для исследования методом ПЦР-РВ служит соскоб эпителиальных клеток (заднебоковой свод влагалища). Клинический материал получают одноразовым стерильным инструментом типа "Cytobrush". Полученный клинический образец помещают в пробирку типа "Эппендорф", содержащую транспортную среду.

Показания к применению метода:
- Наличие субъективных и/или объективных симптомов, связанных с урогенитальным трактом, у женщин репродуктивного возраста вне беременности
- Планирование беременности
- Репродуктивные потери
- Подготовка к экстракорпоральному оплодотворению
- Планируемое оперативное вмешательство в области малого таза

Способ позволяет в короткие сроки объективно:
1. Оценивать качественный и количественный состав вагинального биоценоза
2. Проводить этиологическую диагностику инфекционных заболеваний урогенитального тракта
3. Оптимизировать и индивидуализировать лекарственную терапию
4. Проводить мониторинг эффективности терапии
5. Контролировать качество получения биопробы.

Кроме того, с помощью данного метода имеется возможность одномоментного выявления полной этиологической структуры заболевания, что обеспечивает назначение направленной этиотропной терапии.

Критерии оценки показателей тест-системы "Фемофлор".
Количественную оценку вагинального биоценоза можно проводить как в абсолютных, так и относительных показателях. Количество ДНК искомого микроорганизма в образце принято выражать в геном-эквивалентах (ГЭ), которое пропорционально количеству микроорганизма. Абсолютный показатель, зависит от техники взятия биоматериала.
Относительные количественные показатели биоценоза - количество микроорганизмов из соответствующей группы по отношению к общей бактериальной массе.
Относительные показатели являются более точными и объективными, представлены в форме разницы десятичных логарифмов количества соответствующей группы микроорганизмов и общей бактериальной массы (ОБМ).

- Контроль взятия материала (КВМ)

Необходимым условием корректного количественного анализа вагинального биоценоза является четкое соблюдение техники получения соскоба эпителиоцитов.

Показателем адекватности получения биоматериала является достаточное количество геномной ДНК человека в пробе, источником которой являются эпителиальные клетки, попадающие в пробу при правильной технике взятия биоматериала. Показатель КВМ оценивается в абсолютных значениях, его минимальный пороговый уровень составляет 104. Если КВМ меньше, чем 104, результат ПЦР-РВ количества биоты считается недостоверным. В этом случае рекомендуется повторное получение биоматериала, поскольку в случае низкого уровня КВМ вычисленные соотношения различных групп микроорганизмов могут быть ошибочными.

- Общая бактериальная масса (ОБМ)

ОБМ - показатель, по которому можно судить об общем количестве бактерий, присутствующих в исследуемой биопробе. Показатель оценивается в абсолютных значениях. Для вагинальных соскобов у здоровых женщин репродуктивного возраста эта величина составляет 106 - 109. Снижение ОБМ ниже указанных пороговых значений, соответственно, свидетельствует о недостаточном заселении исследуемого биотопа бактериями, возможно вследствие антибиотикотерапии, гипоэстрогении различного генеза и др.

- Оценка нормофлоры

Основным представителем нормофлоры урогенитального тракта у здоровых женщин репродуктивного возраста являются представители рода Lactobacillus (ЛБ). ЛБ оцениваются как в абсолютных, так и относительных показателях. В норме ЛБ являются главной составляющей ОБМ, поэтому абсолютный показатель уровня лактобацилл практически не отличается от абсолютного показателя общей бактериальной массы и соответствует 106-109 . Относительный показатель ЛБ рассчитывается путем вычисления разницы десятичных логарифмов (Lg) или порядков между абсолютными значениями Lactobacillus (ЛБ) и ОБМ. Например, абсолютный показатель ОБМ составляет 107 - это значит, что Lg этого показателя будет равен 7-ми. В норме разница логарифмов (порядков) между ЛБ и ОБМ находится в интервале от 0 до -0,3. Снижение относительного показателя ЛБ служит одним из критериев дисбаланса биоценоза влагалища. Умеренное снижение относительного показателя ЛБ соответствует интервалу значений от -0,3 до -1,0. Значительное снижение относительного показателя ЛБ соответствует значениям ниже, чем -1,0.

- Оценка аэробной (факультативно анаэробной) и анаэробной условно-патогенной флоры

Количество аэробных и анаэробных условнопатогенных бактерий также оценивается в абсолютных и относительных показателях. Абсолютные количественные показатели приблизительно соответствуют показателям при бактериологичесих исследованиях. Относительный показатель уровня определяемого условно-патогенного микроорганизма (УПМ) рассчитывается при помощи программного обеспечения прибора для ПЦР-РВ путем вычисления разницы десятичных логарифмов (Lg) или порядков между абсолютными значениями конкретного микроорганизма/группы микроорганизмов и ОБМ. В норме разница логарифмов (порядков) между УПМ и ОБМ - меньше -3. Незначительно повышенный уровень соответствует интервалу от -3 до -2. Умеренно повышенный уровень соответствует интервалу от -2 до -1. Значительно повышенный уровень УПМ соответствует значениям разницы с ОБМ большим, чем -1.

- Оценка микоуреаплазм и грибов рода Candida
Количественную оценку микоуреаплазм, а также дрожжеподобных грибов рода Candida, проводят только по абсолютным показателям. Полученные предварительные результаты исследований позволяют предполагать, что пороговым диагностическим уровнем для Ureaplasma (urealiticum+parvum) и Mycoplasma hominis является значение абсолютного показателя 104.

Для дрожжеподобных грибов рода Candida spp абсолютное значение 103 производители тест-системы "Фемофлор" определили как порог чувствительности теста на Candida spp.

Классификация состояния биоценоза
I. Нормоценоз:
1. Нормофлора (Lactobacillus spp) - абсолютный показатель 106-108, относительный показатель - от 0 до -0,3 .
2. Факультативно-анаэробные и облигатно-анаэробные условно-патогенные микроорганизмы - абсолютный показатель <104, относительный показатель - меньше - 3, отдельные представители УПМ могут иметь относительный показатель от -3 до -2 - слабо увеличенный уровень.22
3. Mycoplasma hominis и Ureaplasma (urealiticum+parvum) отсутствуют или их абсолютный показатель < 104.
4. Грибы рода Candida - отсутствуют или их абсолютный показатель < 103.

II. Дисбаланс I степени (умеренный)
1. Нормофлора (Lactobacillus spp) - абсолютный показатель 106-108, относительный показатель - от -0,3 до -1.
2. Факультативно-анаэробные и облигатно-анаэробные условно-патогенные микроорганизмы: абсолютный показатель >104, относительные показатели различных УПМ варьируют от -3 до -1.
3. Mycoplasma hominis и Ureaplasma (urealiticum + parvum) - отсутствуют или абсолютный показатель > 104 .
4. Грибы рода Candida spp. - отсутствуют или абсолютный показатель > 103.

III. Дисбаланс II степени (выраженный)
1. Нормофлора (Lactobacillus spp). - абсолютный показатель может варьировать от полного отсутствия лактобацилл до значений 105-106; относительный показатель - меньше -1.
2. Факультативно-анаэробные и облигатно-анаэробные условно-патогенные микроорганизмы - в большинстве случаев абсолютный показатель больше >105, относительные показатели различных УПМ могут варьировать от -3 до 0, однако относительные показатели хотя бы части УПМ находятся в пределах от -1 до 0.
3. Mycoplasma hominis и Ureaplasma (urealiticum + parvum) могут отсутствовать или абсолютный показатель >104.
4. Грибы рода Candida spp. отсутствуют или абсолютный показатель > 103 .

Классификация дисбалансов в зависимости от этиологической структуры:
Анаэробный - дисбаланс, вызванный преимущественно облигатно-анаэробными микроорганизмами: Gardnerella vaginalis /Prevotella bivia/Porphyromonas spp;
Atopobium vaginae; Eubacterium spp; Sneathia spp /Leptotrihia spp/Fusobacterium spp; Megasphera spp/Veilonella spp/Dialister spp; Lachnobacterium spp/Clostridium spp;
Mobiluncus spp/Corynebacterium spp; Peptostreptococcus spp.
Аэробный - дисбаланс, вызванный преимущественно факультативно-анаэробными микроорганизмами: Enterobacteraceae, Streptococcus spp и Staphylococcus spp.
Смешанный дисбаланс, вызванный сочетанием аэробной и анаэробной бактериальной флоры, возможно в сочетании с дрожжевыми грибами рода Candida.

Проведенные клинико-лабораторное исследования позволяет сделать вывод о целесообразности комплексного лабораторного обследования на инфекции, вызывающие заболевания урогенитального тракта, включая количественное исследование методом ПЦР-РВ условнопатогенной и нормофлоры, а также качественное ПЦР- исследование инфекций, передаваемых половом путем, и вирусов.

Комплексное ПЦР-исследование, включающее количественное исследование биоты урогенитального тракта методом ПЦР-РВ и качественное ПЦР-исследование ряда бактериальных и вирусных патогенов позволяет верифицировать диагноз инфекционно-воспалительного процесса: объективно определить его распространенность, выраженность и этиологию. Это особенно важно в случаях с неясной клинической симптоматикой и на ранних стадиях заболевания, когда использование стандартных методов лабораторной диагностики неэффективно.

Тест-системы "Фемофлор" позволяет определить степень выраженности дисбаланса, который может быть умеренным и выраженным. Выраженный дисбаланс, как правило, носит системный (в пределах мочеполовой системы) характер. Умеренный дисбаланс влагалищного биоценоза может быть как системным (в пределах мочеполовой системы), так и локальным (в пределах одного биотопа), иметь как постоянный, так и транзиторный характер, быть результатом общетерапевтических заболеваний, системной антибиотикотерапии или быть началом воспалительного процесса, вызванного инфекционным возбудителем.

Используемая литература:
1. Болдырева М. Н. "Фемофлор" исследование биоценоза урогенитального тракта у женщин репродуктивного возраста методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени. - методическое пособие для врачей, 2010
2. Болдырева М. Н."Фемофлор" исследование биоценоза урогенитального тракта у женщин репродуктивного возраста методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени.- методическое пособие для врачей, 2010.
3. Болдырева М.Н., Липова Е.В., Трофимов Д.Ю., Витвицкая Ю.Г., Гуськова И.А. Особенности биоты урогенитального тракта здоровых женщин репродуктивного возраста при исследовании методом ПЦР в режиме реального времени.- Вестник дерматологии и венерологии.- 2010- №1.
4. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Т.2.: Пер. с англ./Под ред. Дж.Хоулта, Н.Крига, П.Снита, Дж.Стейли, С.Уильямся.-М.: Мир. 1997.