Быстрый и точный метод лабораторной диагностики
бактериальных менингитов

Менингит – острое полиэтиологическое заболевание, характеризующееся наличием очагов воспаления в мягких мозговых оболочках и/или желудочках мозга. Менингиты классифицируются по характеру изменения ликвора, возбуди­теля инфекции, происхождением (первичный, метастатический), течением и анатомической локализацией. Наибольшее практическое значение имеет деление менингитов по этиологии заболевания и типу ликворных изменений: гнойный (бактериальный) и серозный (асептический).

Этиологическая структура менингитов

Как видно из таблицы этиологическая структура менингитов напрямую зависит от возраста пациентов и характером нейротравмы. Таким образом, формулирование диагноза менингита только по характеру ликвора (гнойный или серозный) без идентификации причины заболевания на сегодняшний момент рассматривается как неудовлетворительная диагностика. Данное положение основывается на следующих аспектах: 1)  с позиции противоэпидемического надзора – проведение целенаправленных профилактических мероприятий, 2)  клиническом – рациональная этиотропная терапия и возможность прогноза исхода заболевания, 3)  социально-экономическом – эффективное расходование средств на профилактику, лечение и реабилитацию. В этом отношении наиболее акутальным является этиологическая расшифровка гнойных бактериальных менингитов (ГБМ), т.к. именно в данном случае у врача есть реальное и быстрое средство спасти жизнь и здоровье пациенту – выбрать нужный антибиотик!

По данным различных национальных служб эпиднадзора стран СНГ по контролю за инфекционной заболеваемостью на территории содружества около 65% случаев ГБМ были менингококковой этиологии (N.meningitidis), 20% - пневмококковой этиологии (S.pneumoniae), 10% случаев были вызваны гемофильной палочкой типа b (Haemophilus influenzae типа b или Hib) и 5% - прочими бактериями. Так, к примеру, заболеваемость менингококковой инфекцией и другими видами ГБМ в РФ превышает 5000 случаев в год при летальности от 5 до 20%.

Современные методы генодиагностики ГБМ основаны на применении полимеразной цепной реакции (ПЦР). Принцип ПЦР заключается в многократной амплификации генетического материала, содержащегося в исследуемом образце, с помощью фермента термостабильной ДНК-полимеразы. При генодиагностике ГБМ в качестве образца используются исходно стерильные жидкости организма человека, в первую очередь, спинномозговая жидкость (СМЖ). Идентификации подвергают фрагменты генома любых возбудителей ГБМ, и в частности, ДНК менингококков, пневмококков и гемофильной палочки. По сравнению с традиционными методами микробиологической диагностики применение ПЦР-технологии отличается быстротой исполнения, высокой чувствительностью и позволяет использовать образцы биологического материала (например, ликвора), в которых достаточно наличие только фрагментов микробной ДНК, иными словами на фоне антибиотикотерапии!

Показания к применению диагностики ПЦР методом.

Показания к применению метода ПЦР начинаются там, где возникают противопоказания к применению классических микробиологических методов. Идентификация патогена путем микробиологического культивирования из образцов СМЖ или крови больного, оставаясь "золотым стандартом" диагностики, имеет серьезные ограничения, обусловленные применением антибиотиков на догоспитальном этапе. Так, согласно рекомендациям по оказанию неотложной помощи на до- и госпитальном этапе больным с менингококковой инфекйией говорится: "…на дому следует ввести разовую дозу пенициллина, а при тяжелой менингококцемии предпочтительнее введение левомицетина-сукцината". Подобная практика улучшает прогноз заболевания, но резко снижает число образцов СМЖ, пригодных для микробиологического и последующего эпидемиологического анализа. Безотлагательность в проведении такой тактики объективно приводит к тому, что культуру бактерий из СМЖ (или крови) удавалось получить лишь в 30% случаев у больных с  ГБМ. Кроме того, бактериологическая диагностика занимает не менее суток. Таким образом, ситуация требует разработки и применения "некультуральных" методов идентификации возбудителей ГБМ. Известным "некультуральным" методом выявления антигенов возбудителей ГБМ является метод латекс-агглютинации  (ЛА) с применением соответствующих коммерческих тест-систем. Латексные частицы, покрытые специфическими антителами к антигенам Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae или Haemophilus influenzae, агглютинируют в присутствии бактериальных антигенов, содержащихся в СМЖ; результат агглютинации оценивается визуально. Постановка всей реакции занимает около 10 мин, реакция не требует наличия живых бактерий в СМЖ. Опыт работы многих отечественных специалистов свидетельствует, что лабораторное подтверждение ГБМ с использованием ЛА достигает 60-70%. Однако чувствительность метода ЛА сравнительно невысока, порядка 70% , что не удивительно, поскольку минимально определяемая концентрация бактерий в СМЖ методом ЛА составля­ет по литературным данным от 10⁵до 5*10⁶ бактерий/мл или от 1 до 50 нг антиге­на/мл.

При этом стоимость тест-систем фирмы BioMerieux (и аналогичных наборов фирм Sanofi-Pasteur, Becton-Dickinson, Murex) в пересчете на одну диагностичес­кую реакцию не менее $10.

Основные достоинства диагностики ГБМ методом ПЦР - возможность выявления даже нескольких копий генома бактерий в ликворе на фоне проводимой антибиотикотерапии и, как следствие этого: максимальная чувствительность и специфичность, достигающие 100%, экспресс-диагностика (ответ в течение нескольких часов), высокая воспроизводимость и экономичность.

Таким образом, показаниями к диагностике ГБМ методом ПЦР являются:

Прямых противопоказаний к применению к диагностике ГБМ методом ПЦР не существует. Однако, с одной стороны, ПЦР способна выявить малейшее бактериальное загрязнение тестируемого образца и рабочих растворов; с другой стороны, в ряде биологических жидкостей, в том числе, СМЖ возможно присутствие ингибиторов ПЦР. Поэтому только использование при постановке реакции положительных и отрицательных контролей, высокое и периодически проверяемое качество всех используемых реагентов, аккуратность выполнения исследования позволяют избежать как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов.

Взятие и хранение образцов СМЖ

Образцы СМЖ забираются у больных ГБМ, желательно при поступлении в стационар, в рамках обычной диагностической спинномозговой пункции. Рекомендуется использование одноразовых пункционных игл и стерильных одноразовых пробирок (типа “Эппендорф”), в противном случае возможно появление ложноположительных результатов. Для ПЦР-диагностики обычно достаточно от 0.1 до 0.5 мл СМЖ. Использование иных стерильно взятых образцов (кровь, аутопсийные материалы) возможно, но при ГБМ имеет меньшее значение. Приготовленные подобным образом бактериальные суспензии или образцы СМЖ могут быть исследованы немедленно, сохраняться в течение 1-3 дней при 4^оС или быть подвергнуты глубокой заморозке. При –20⁰С образец может храниться несколько месяцев, при –70⁰С практически неограниченно. Следует избегать нескольких циклов замораживания-оттаивания образца, поэтому, если образец планируется исследовать неоднократно, аликвоты должны быть разлиты в отдельные пробирки.

Ожидаемый клинический эффект метода ПЦР в диагностике ГБМ

Целесообразность использования метода ПЦР складывается из нескольких компонентов. Во-первых, ПЦР позволяет диагностировать в два с половиной раза больше случаев менингококкового менингита и в два раза больше случаев пневмококкового и гемофилюсного менингита по сравнению с культивированием. Во-вторых, сроки получения ответа методом ПЦР составляют 6-8 часов, тогда как в условиях стандартной микробиологической диагностики – более 24 часов. В-третьих, себестоимостью метода ПЦР, не превышающей себестоимости стандартных микробиологических исследований, особенно, если последние дополняются методом ЛА.

Клинические подходы к терапии менингитов различной этиологии не совпадают, поэтому своевременная дифференциальная диагностика является важным элементом эффективного лечения. Кроме того, использование метода ПЦР при диагностике менингококковой инфекции дает возможность к расширенному серотипированию нейссерий, что в свою очередь позволяет принять решение о целесообразности проведения вакцинации населения.

Обсуждаемые в данном пособии методики являются не заменой традиционных и апробированных микробиологических методик, но их существенным и необходимым дополнением. Широкое применение генодиагностики и генотипирования позволит повысить уровень диагностики менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов и предоставит возможность более полного эпидемиологического слежения за распространенностью различных вариантов их возбудителей.

ЛИТЕРАТУРА

Ураження центральної нервової системи при інфекційних захворювань у дітей: навч.посібник/ Л.Р. Шостакович-Корецька, Л.А. Дзяк, І.В. Будаєва та ін.– Дніпропетровськ: АРТ-ПРЕС, 2004.- 284 с.

Платонов А.Е., Шипулин Г.А., Тютюнник Е.Н., Платонова О.В. Генодиагностика бактериальных менингитов и генотипирование их возбудителей. Пособие для врачей, ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ, Москва, 2001 г.

The Sanford Guide to Antimicrobial Therapy –35^th.Ed., 2005., p.4.